摘要】  目的： 探討天麻素對(duì)血管性癡呆(VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬p53表達(dá)的影響。方法: 將大鼠隨機(jī)分成模型組、對(duì)照組、治療組(高劑量天麻素組和低劑量天麻素組)，采用改良Pulsinelli四血管閉塞法(4VO)建立VD大鼠模型，天麻素高劑量組模型大鼠用天麻素80 mg·kg-1·d-1灌胃，天麻素低劑量組模型大鼠用天麻素40 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)4周。水迷宮檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠海馬p53免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。結(jié)果: 與VD模型組比較，天麻素治療后VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高，海馬p53免疫陽(yáng)性神經(jīng)元明顯減少(P < 0.01)，以高劑量天麻素組效果更顯著。結(jié)論: 天麻素可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與下調(diào)p53表達(dá)、抑制缺血海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】  癡呆，血管性; 海馬; 蛋白質(zhì)p53; 迷宮學(xué)習(xí); 記憶; 天麻素

The Effect of Gastrodine on Learning Capability, Memory and p53　Expression in Hippocampus of Vascular Dementia Model Rats

　　GAO Dongli, PAN Ya, LI Yongjiang, CHEN Can, ZHANG Min

　　(Department of Physiology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)

　　[Abstract] Objective: To study the effect of gastrodine on learning capability, memory and expression of p53 in hippocampus of vascular dementia (VD) model rats. Methods： The experimental rats were randomly divided into four groups: VD model group (group V), control group (group C), and high dose (group H) and low dose (group L) of gastrodine treatment groups. VD models were established with improved Pulsinelli four vessel occlusion (4VO)method. Gastrodine was administered intragastrically with doses of 80 mg·kg-1·d-1 and 40 mg·kg-1·d-1 to rats in groups H and L respectively daily for 4 weeks.Learning and memory abilities of rats in 4 groups were evaluated with Morris Water Maze test，and the expressions of p53 proteinum in hippocampus dentate gyrus (HDG) were examined by immunohistochemistry method. Results： The learning and memorizing abilities were significantly improved in groups H and L compared with those of group C. Expression of p53 was lower in both treatment groups, than that of group C (P<0.01), and treatment of high dose gastrodine was even more effective. Conclusions: Gastrodine can improve the learning and memorizing abilities of VD model rats. The downregulation of p53 and inhibition of ischemia hippocampus nerve cell apoptosis might be potential mechanism for the improving effects of gastrodine.

　　[Key words] dementia,vascular; hippcampus; protein p53; maze learning; memory; gastrodine

　　血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)是指由腦缺血缺氧所引起的獲得性智能損害綜合征，是老年期癡呆的主要類型之一。腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡除有壞死外，還存在凋亡形式，因此抑制缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)保護(hù)神經(jīng)元具有重要意義。p53是促凋亡基因之一 ，在DNA損傷、癌基因的激活等能發(fā)揮重要作用[1]。天麻素(Gastrodin，Gas)是從天麻中提煉出的主要有效成分，藥理實(shí)驗(yàn)證明有較強(qiáng)的生物活性[2]。2008年7月～2009年4月用天麻素灌胃處理VD大鼠，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及大鼠海馬p53表達(dá)水平，探討天麻素對(duì)VD的影響及其分子機(jī)制。

　　1 材料與方法

　　1.1 動(dòng)物與試劑

　　健康、雄性SD大鼠80只，4～5月齡，體重300～330 g，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：SCXY(黔)2002-0001]。p53檢測(cè)試劑盒由北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 動(dòng)物分組和造模 大鼠隨機(jī)分成4組，對(duì)照組、模型組、天麻素高劑量組、天麻素低劑量組，每組20只。采用改良Pulsinelli四血管阻斷法建立VD動(dòng)物模型[3]。模型組、天麻素高劑量組及天麻素低劑量組燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞，24 h后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，5 min /次，共3次，每次間隔1 h。對(duì)照組除不燒灼椎動(dòng)脈和夾閉頸總動(dòng)脈外，其余步驟同前。模型制作完成后，高劑量組按80 mg·kg-1·d-1 (2 ml)給予天麻素灌胃，低劑量組按40 mg·kg-1·d-1 (2 ml)給予天麻素灌胃;對(duì)照組及模型組給予等量生理鹽水。每天1次，共4周。

　　1.2.2 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 各組大鼠于造模后第4周開(kāi)始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。第1～6天行定向航行試驗(yàn)，每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的順序從各入水點(diǎn)(各象限水池壁中點(diǎn))靠池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠從水中爬上站臺(tái)所需時(shí)間為逃避潛伏期;第7天行空間探索試驗(yàn)，將大鼠從第Ⅰ象限入水點(diǎn)放入水池，記錄2 min內(nèi)大鼠在第Ⅲ象限游泳時(shí)間和穿越站臺(tái)次數(shù)。

　　1.2.3 p53的表達(dá) 水迷宮測(cè)試后，大鼠麻醉，經(jīng)左心室插管，分別用生理鹽水、10%中性甲醛灌注固定，注畢斷頭取腦，置于10%中性甲醛液中浸泡固定。取海馬齒狀回記錄點(diǎn)前后約3 mm厚標(biāo)本，經(jīng)梯度脫水、透明及石蠟包埋后，行冠狀位切片，片厚4～5 μm。免疫組織化學(xué)PV二步法檢測(cè)大鼠海馬p53，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)操作。切片脫水、透明、中性樹(shù)膠封片后，采用Leica攝像顯微鏡采圖，ImagePro Plus 6.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)分析，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野采集一幅圖像，進(jìn)行平均光密度(AOD)測(cè)量，取平均值作為最后結(jié)果。

　　1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示。先進(jìn)行單因素方差分析，組間差異采用SNK檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

　　貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) 34卷 4期高冬麗等 天麻素對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬p53表達(dá)的影響

         2 結(jié)果

　　2.1 學(xué)習(xí)記憶能力

　　定向航行實(shí)驗(yàn)中的平均逃避潛伏期反映大鼠的學(xué)習(xí)能力，結(jié)果見(jiàn)表1。模型組大鼠平均逃避潛伏期與對(duì)照組比較明顯延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01)天麻素組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短(P<0.01)。高劑量組與低劑量組比，從第2天開(kāi)始平均逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)反映大鼠的記憶能力，結(jié)果見(jiàn)表2。模型組與對(duì)照組比較，第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間縮短、穿越站臺(tái)次數(shù)減少(P<0.01)。天麻素組與模型組比較，第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)、穿越站臺(tái)次數(shù)增多(P<0.01，P<0.05)。高劑量組與低劑量組比較，第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，穿越站臺(tái)次數(shù)增多(P<0.01，P<0.05)。表1 各組大鼠定向航行實(shí)驗(yàn)平均逃避潛伏期(　表2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間和穿站臺(tái)次

　　2.2 p53陽(yáng)性神經(jīng)元

　　各組大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層p53陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。p53免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物為神經(jīng)元胞核內(nèi)棕黃色沉淀物，少量分布在胞漿內(nèi)。對(duì)照組神經(jīng)元胞核p53免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物明顯減少，染色極淺(圖2A)，模型組大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層有較為密集的p53免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布，染色深(圖2B)。天麻素組神經(jīng)元細(xì)胞核p53免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物明顯減少，染色較淺，與低劑量組比較，高劑量組神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)p53免疫陽(yáng)性反應(yīng)顆粒表達(dá)水平少，染色淺，兩者AOD值差異明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖2C、2D。

　　3 討論

　　天麻為蘭科多年寄生草本植物天麻(Gastrodia elata Blume)的干燥塊莖，對(duì)眼黑頭眩、四肢拘攣、小兒風(fēng)癇、蠱毒惡氣等具有良好功效。天麻素(gastrodin)為天麻的主要成分，又稱天麻苷，化學(xué)名為對(duì)羥甲基苯β D 吡喃葡萄糖苷，含量為0.33%～0.67%，藥理實(shí)驗(yàn)證明天麻素有較強(qiáng)的生物活性，常作為衡量天麻藥材和制劑質(zhì)量的指標(biāo)成分。近年來(lái)，對(duì)天麻素的藥理作用及機(jī)制研究也越來(lái)越受到關(guān)注，一般認(rèn)為，天麻素對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用及延緩細(xì)胞衰老的作用可能與其具有清除自由基、改善腦循環(huán)、抑制興奮性氨基酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和凋亡的能力有關(guān)[4,5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠找到站臺(tái)的時(shí)間比對(duì)照組大鼠明顯延長(zhǎng);第7天撤去站臺(tái)后，模型組大鼠第Ⅲ象限游泳時(shí)間和穿越站臺(tái)次數(shù)比對(duì)照組明顯減少，尋找站臺(tái)的軌跡以穿梭游泳和環(huán)池游泳為主。結(jié)果表明，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較對(duì)照組明顯減退，運(yùn)用4VO改良法成功復(fù)制了VD模型大鼠。用天麻素治療后，大鼠找到站臺(tái)的時(shí)間較模型組明顯減少，以穿梭游泳和繞站臺(tái)游泳為主，學(xué)習(xí)記憶成績(jī)和游泳軌跡接近對(duì)照組，提示天麻素能有效改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，尤其是高劑量組大鼠的選擇正確率顯著提高，治療效果更佳。

　　近年來(lái)的研究顯示，隨著缺血性損傷嚴(yán)重性和持續(xù)時(shí)間等的不同可導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)元壞死和凋亡[6，7]。目前公認(rèn)p53是最常見(jiàn)的促凋亡基因之一 ，p53及其相關(guān)基因在腦缺血中的表達(dá)調(diào)控已成為目前缺血神經(jīng)元死亡機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。VD的重要病因是大腦缺血缺氧，海馬是缺血性腦損傷中最敏感的腦區(qū)，VD發(fā)病時(shí)海馬存在明顯的細(xì)胞凋亡，其發(fā)生的病理基礎(chǔ)是彌漫性或局灶性腦缺血引起海馬結(jié)構(gòu)或與海馬記憶相關(guān)的聯(lián)系通路的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且凋亡細(xì)胞越多癡呆越嚴(yán)重。有實(shí)驗(yàn)研究，腦缺血促進(jìn)p53的表達(dá)，在介導(dǎo)缺血性神經(jīng)元損傷中起重要作用[8]。因此認(rèn)為，檢測(cè)大鼠海馬組織中p53蛋白的表達(dá)情況，可作為反映腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的間接指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層有較為密集的p53免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布，神經(jīng)元胞核內(nèi)有豐富p53免疫陽(yáng)性反應(yīng)沉淀物，染色深。治療組神經(jīng)元胞核p53免疫陽(yáng)性神經(jīng)元明顯減少，p53免疫陽(yáng)性沉淀物染色較淺，以高劑量天麻素效果更顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示應(yīng)用天麻素有拮抗細(xì)胞凋亡的作用，可抑制腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，顯著下調(diào)p53促凋亡基因，對(duì)癡呆模型大鼠腦內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬區(qū)的神經(jīng)元起到了保護(hù)作用。認(rèn)為其下調(diào)p53促凋亡基因的可能機(jī)制與降低興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、拮抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用、抑制神經(jīng)細(xì)胞損傷、增強(qiáng)免疫及抑制氧自由基系統(tǒng)代謝紊亂有關(guān)[9～11]。也有資料表明p53 基因參與促凋亡蛋白Bax的表達(dá)[7]。研究已證實(shí)p53是bax基因的直接轉(zhuǎn)錄因子,其水平升高可以引起隨后bax基因表達(dá)增加，導(dǎo)致膜通透性增加，細(xì)胞色素C由線粒體釋放入胞漿，激活天冬氨半胱氨酸酶(caspase)系統(tǒng)，誘導(dǎo)凋亡[12]。因而，p53在缺血誘導(dǎo)凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

　　所以，拮抗缺血性腦病所致癡呆病人神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)海馬神經(jīng)元抗缺氧及抗自由基損傷的能力，改善腦缺血狀態(tài),可能是天麻素改善癡呆癥狀的作用機(jī)理之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量天麻素組的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于低劑量天麻素組，提示高劑量天麻素比低劑量天麻素作用效果更強(qiáng)，在改善學(xué)習(xí)記憶能力、對(duì)抗VD癥狀更顯著。但天麻素是通過(guò)何種途徑降低VD大鼠海馬p53的表達(dá)，尚值得進(jìn)一步研究。